Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Summary

Apresentamos um protocolo para capturar a dinâmica da regeneração da barbatana caudal de larvas de peixe-zebra em uma escala de tecido inteiro usando estereomicroscopia baseada em campo claro. Esta técnica permite capturar a dinâmica de regeneração com resolução de célula única. Esta metodologia pode ser adaptada a qualquer estereomicroscópio equipado com uma câmera CCD e software de lapso de tempo.

Abstract

A barbatana caudal larval do peixe-zebra é ideal para estudar a regeneração tecidual devido à arquitetura simples da dobra da barbatana larval, que compreende duas camadas de pele que envolvem mesênquima indiferenciado, e porque a barbatana caudal larval se regenera rapidamente em 2-3 dias. Usando este sistema, demonstramos um método para capturar a dinâmica de reparo da barbatana caudal amputada com estereomicroscopia de campo claro de vídeo com lapso de tempo. Demonstramos que a amputação da barbatana desencadeia uma contração da ferida de amputação e extrusão de células ao redor da margem da ferida, levando à sua subsequente eliminação. A regeneração das nadadeiras prossegue da direção proximal para a distal após um pequeno atraso. Além disso, o crescimento do desenvolvimento da larva pode ser observado durante todos os estágios. O método apresentado oferece uma oportunidade para observar e analisar comportamentos em escala de tecido inteiro, como desenvolvimento e crescimento de barbatanas em uma configuração de microscópio simples, que é facilmente adaptável a qualquer estereomicroscópio com recursos de lapso de tempo.

Introduction

A capacidade de um organismo de orquestrar processos de reparo tecidual após a lesão é crucial para sua sobrevivência ¹. Embora todos os animais tenham a capacidade de curar suas feridas, a extensão em que os tecidos se regeneram difere muito entre as espécies. Espécies de vertebrados como o peixe-zebra, as salamandras e os girinos de rã têm a notável capacidade de regenerar tecidos perdidos, incluindo seus apêndices, partes de seus olhos, coração e sistema nervoso central ^2-4. Espécies de mamíferos, como o camundongo espinhoso africano e os coelhos, são capazes de regenerar buracos em suas orelhas ^5-7, e humanos e camundongos regeneram porções de seu fígado, bem como suas pontas dos dedos durante os estágios fetal e juvenil ^8-12. Embora ainda não seja bem compreendido por que e como certas espécies regeneram tecidos de forma mais eficaz do que outras, a presença de vias genéticas semelhantes sugere que esses mecanismos podem estar adormecidos em espécies sem grande potencial de regeneração ^13,14. Assim, elucidar os mecanismos de reparo e regeneração tecidual em espécies com resultados satisfatórios de regeneração beneficiará a regeneração em humanos.

Escolhemos a barbatana caudal larval de peixe-zebra como um paradigma para demonstrar sua regeneração com estereomicroscopia de campo claro de lapso de tempo. A barbatana caudal larval do peixe-zebra é anatomicamente simples em comparação com as estruturas adultas mais complexas, consistindo em um epitélio dobrado de duas camadas com axônios somatossensoriais inervando a pele que circunda as células mesenquimais localizadas medialmente ¹⁵. Apesar das diferenças anatômicas, a regeneração da barbatana caudal larval é um pouco comparável à regeneração da barbatana adulta em termos de assinaturas moleculares e respostas de crescimento ^16,17. Em comparação com a barbatana adulta, a regeneração da barbatana caudal larval tem, no entanto, várias vantagens: 1) a regeneração da barbatana larval é concluída em apenas 2-3 dias ¹⁶, 2) as larvas podem ser montadas em agarose de baixo derretimento e 3) as larvas não requerem alimentação até ~ 5 dias após a fertilização (dpf) devido à presença do saco vitelino. Isso torna as larvas de peixe-zebra ideais para observar a dinâmica de reparo tecidual in vivo.

O método apresentado permite a captura de dinâmicas detalhadas subjacentes aos processos iniciais de regeneração de barbatanas. Muitos estudos utilizaram microscopia confocal baseada em fluorescência para estudar processos biológicos celulares e subcelulares em peixes-zebra embrionários e larvais. No entanto, configurações sofisticadas de imagens confocais geralmente não são acessíveis a todos e são altamente caras em comparação com outras técnicas de imagem. Em contraste, a metodologia apresentada utiliza um estereomicroscópio Discovery V12 equipado com o software Axiovision e um módulo de lapso de tempo, fornecendo assim uma alternativa mais acessível ao equipamento de imagem caro para examinar o comportamento do tecido. Demonstramos que este método pode ser utilizado para imagens de regeneração tecidual com alta resolução temporal a um custo mínimo. As implicações para este método podem se estender além da biologia básica para avançar nos estudos de regeneração de mamíferos usando culturas de órgãos, para desenvolvimento terapêutico por meio de triagens farmacológicas e genéticas, e pode servir como uma ferramenta de ensino em sala de aula.

Protocol

Peixe-zebra (nácar cepa) foram nascidos e criados de acordo com os protocolos estabelecidos. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento, usando tricaina 0,4 mM para anestesia e tricaina 1 mM para a eutanásia. Embriões de peixes-zebra e larvas foram tratadas em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como aprovado pela comissão competente (Laboratório Biológico MDI animais núcleo número IACUC 13-20). Este estudo foi aprovado pelo Instituto de Pesquisa do Genoma Humano Animal Care e Use Comitê Nacional, MDIBL Institucional Assurance # A-3562-01 sob o protocolo nº 14-09.

Nota: O procedimento de imagiologia que capta a regeneração da barbatana no peixe-zebra larval é resumido nas seguintes etapas:

1. Criação de peixe-zebra para estágios larvais

1. Recolher os ovos e coloque cerca de 50 ovos em um prato 100 x 25 mm Petri contendo 0,03% de sal Instant Ocean em água deionizada suplementado com 0,00004% de azul de metileno. Incubar O / N em uma incubadora de 28,5 ° C.
2. Na manhã seguinte, retire os embriões mortos com uma pipeta de vidro e lave os ovos em uma peneira com 0,03% de sal Instant Ocean em água deionizada (médio embrião denominado).
   Nota: Média de Ringer como ^{18, 18 de} Hanks, ¹⁹ E2, E3 ^20, e Danieau ²¹ pode ser preferido.
3. sup> Adicionar meio embriões frescos para o prato. Se utilizando estirpes pigmentadas, adicionar opcionalmente 0,2 mM de 1-fenil-2-tioureia (PTU), como propiltiouracil irá impedir a melanogénese e, assim, a pigmentação das larvas. Deixe os embriões desenvolver na incubadora até a fertilização dois dias post ou qualquer outra fase larval desejado.

2. Preparação da câmara de imagem

1. Método 1: câmaras de imagem feitos de PVC ou tubagem de Teflon (Figura 1)
   Nota: Este método é semelhante ao Concha e Adams (1998) ^22.
   1. Adquirir plástico grau de água potável ou tubo Teflon de uma loja de hardware com um 25 milímetros um exteriorDA 20 mm de diâmetro interior. Cortar o tubo para fazer anéis de aproximadamente 10 mm de espessura, com uma superfície uniforme de cada lado. Use> 200 lixa para suavizar as bordas.
   2. Limpe os anéis com água morna e 70% de etanol e deixe-os secar ao ar.
   3. Com uma ponta de pipeta, aplique graxa de silicone para a metade de um anel e anexar o anel para a 75 milímetros x 25 mm deslizamento tampa de vidro. Como alternativa, use uma seringa de 3 ml preenchido com graxa de silicone em vez de uma ponteira.
      Nota: Porque é difícil de inserir a massa de silicone para dentro da seringa de 3 ml, adicionar a gordura de silicone para uma seringa de 30 ml primeiro e usar esta para encher a seringa de 3 ml.
2. Método 2: Preparação de uma placa de Petri como uma câmara de imagem.
   1. Adquirir 35 ou 60 mm de diâmetro de placas de Petri com uma lamela de vidro fixada na tampa (Figura 2A). Em alternativa, como mostrado na Figura 3 de Distel & Koester (2007) ^23, perfurar uma abertura suficientemente pequeno para huma lamela de idade na tampa de uma pequena placa de Petri e aplicar gordura de silicone para o exterior com uma seringa de 3 ml. Utilizando uma ponta de pipeta limpa, cuidadosamente anexar uma forma redonda ou quadrada lamela da espessura desejada para o exterior (Figura 2B).
3. Para garantir que a agarose sendo usado para a montagem mantém firmemente ligado durante o procedimento de imagem, coloque uma malha de plástico fino dentro do ringue. Em primeiro lugar, cortar a malha feita de tela de janela obtidos a partir de uma loja de hardware, no tamanho do diâmetro do anel interior, utilizando uma tesoura fina com um ângulo. Em seguida, corte um pequeno rectângulo> duas vezes o tamanho da larva para o meio da malha (Figura 1, 2).
4. Aplicar quatro pequenos pontos de gordura de silicone não-tóxico para a interface entre a cobertura de vidro e o anel de câmara (Figura 1A).
5. Use uma pinça para ligar a malha firmemente a parte inferior da lamela de vidro.

3. Montagem e imagem do Pré-injured Larva (este passo é opcional)

Nota: Esta etapa é apropriado para comparações entre o comprimento da nadadeira amputada e regenerado, como o plano de amputação após a regeneração fin não é reconhecível em larvas do peixe.

1. Prepara-se uma solução de agarose a 0,5-1,2% de baixo ponto de fusão em forma embrião para a imobilização do espécime.
2. Aquecer a agarose, num forno de microondas e transferir o líquido de agarose em tubos de 1,5 ml que são pré-aquecidas a 42 ° C num bloco de aquecimento.
3. Deixe a agarose quente arrefecer para 42 ° C, que pode ser mantida ao longo de várias semanas a esta temperatura. Tente evitar a pipetagem as larvas em agarose acima de 42 ° C, pois isso será prejudicial para os animais.
4. Anestesiar várias larvas usando 10 ml de tricaina 0,4 mM (pH 7) em forma de embriões em uma placa de Petri de diâmetro de 60 mm. Prepare o tricaina de acordo com as Receitas Livro Zebrafish ^18.
   1. Em alternativa, utilizar 10 ml de uma diluição de 1: 1000 99% 2-fenoxietanol em uma placa de Petri de diâmetro de 60 mm. Pique as larvas com uma ponta microloader pipeta tampada, para avaliar a sua resposta ao toque antes de prosseguir. Use apenas larvas não-responsivos.
5. Transferir uma larva na solução de agarose a 42 ° C utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro. Não transferir o líquido excessivo no agarose, caso contrário, a agarose será muito diluída e não solidificar.
6. Descartar o líquido restante a pipeta de transferência e a larva com uma gota de agarose numa pequena placa de Petri (35 ou 60 mm de diâmetro). Posicione a larva em seu lado para geração de imagens da barbatana caudal.
7. Permitir que a agarose solidificar. Avaliar a agarose com uma ponta de pipeta de plástico; a ponta vai mergulhar no agarose, se for muito líquido. Uma vez que a agarose solidificou, um pequeno recuo será visível ao tocar com a ponta da pipeta. Após a solidificação, adicionar solução tricaina e siga para o microscópio estereoscópico que será usada mais tarde para geração de imagens de lapso de tempo.
   Nota: Este passo pode também ser realizado através da colocação a larva anestesiado numa placa de Petri revestidas com agarose a 1,5% em meio de embrião.
8. Use um microscópio estereoscópico com software time-lapse. Selecione um objectivo adequado e ampliação, que será utilizado mais tarde para imagens de lapso de tempo. Aqui, use um 3,5 x 16 milímetros, objectiva de distância trabalhando em um microscópio estereoscópico. Como desejado, utilizar microscópios alternativos e lentes objetivas, mas escolher uma ampliação adequada para explicar potencial xy-drift e crescimento da barbatana durante o procedimento de imagem.
9. Escolha do modo de detecção de câmara no microscópio.
10. No software, selecione o modo "ao vivo" para visualizar a larva na tela.
11. Abra a janela "Propriedades" para detectar automaticamente o brilho.
12. Ajustar manualmente o contraste ao microscópio base de trans-iluminação.
13. Mova a larva para fora do campo de visão e selecione o recurso Correção Shading para minimizar fundo nãoise.
14. Posicione a larva de volta para o campo de visão e tirar uma foto. Salve a imagem.
15. Retire a agarose da larva pela primeira raspando a agarose fora da cabeça. Desta forma, a larva pode ser deslizado para fora da agarose, puxando levemente a cabeça longe do restante agarose com uma ponta microloader pipeta tampado ou um pino de insetos.
16. Com uma pipeta de Pasteur de vidro transferir a larva em solução tricaina fresco.

4. Amputação Assay

1. Prepare uma solução de agarose a 1,5%, utilizando meio de embrião e despeje uma camada fina em uma placa de Petri. Deixe o agarose solidificar.
2. Sob um microscópio estereoscópico, coloque o sideward larva para a agarose solidificada e amputar a nadadeira caudal com uma agulha de seringa de 23 G com uma ligeira pressão (Figura 3A).

5. Montagem da Larva para tempo-lapso

1. Proceder como descrito nos passos 3,1-3,5 (Figura 3B).
2. Transferir uma gota de 0,5-1,2% de agarose líquido a 42 ° C contendo a larva no anel câmara de imagem (passo 2.1), orientar a larva e deixar solidificar a agarose. Encha o anel com solução tricaina. Alternativamente, se a câmara de caixa de Petri (passo 2.2), é utilizada, para montar a larva da lamela tampa e preencher a tampa com solução tricaina.
3. Para permitir a cicatrização adequada ou regeneração de tecidos a ocorrer, com cuidado raspar a agarose em torno da barbatana caudal distal utilizando uma ponta microloader pipeta tampado ou um pino de insetos. Tente não ferir o fin repetidamente (Figura 3C).
4. Decantar a solução tricaina contendo o removido agarose e preencher o anel de câmara com solução tricaina fresco.
5. Aplique graxa de silicone para o topo do anel de câmara e anexar com 75 mm x 25 mm lâmina de vidro. Tentar evitar bolsas de ar na câmara, à medida que vão interferir com as imagens de campo claro e desidratar a larva ao longo do tempo.
6. Se estiver usando uma placa de Petri comouma câmara de imagem, aplique graxa de silicone para a borda superior da câmara de fundo e encher a câmara inferior com solução tricaina. Decantar cuidadosamente a solução tricaina na tampa e gire a tampa sobre a mergulhar a larva na solução tricaina da câmara de fundo em um pequeno ângulo para evitar bolhas de ar. A câmara será selado devido à graxa de silicone.

6. tempo-lapso

1. Montar uma câmara de incubação aquecida como descrito no ^23,24 (Figura 4) .Colocar a câmara de incubação em torno do microscópio e ligar o aquecimento. Ajustar a temperatura para 28 ° C durante cerca de 10 - 20 minutos ou até que a temperatura tenha estabilizado.
2. Abra a parte frontal da câmara de incubação aquecida e colocar a câmara de imagem no suporte da lamela de microscópio com voltada para cima no sentido do objectivo.
3. Posicionar o fin de larvas de uma maneira que 2/3 do campo de visão permanece desocupado. Isto assegura a captura docrescimento e regeneração da barbatana ao longo do procedimento de imagiologia, sem ter de reposicionar a larva.
   1. Ajustar a larva montada a 28 ° C durante ~ 30 min antes de se iniciar a gravação de lapso de tempo para evitar mudanças na intensidade de campo claro ou potenciais alterações de agarose. Em alternativa, utilizar tampão pré-aquecido para começar imagem após curto tempo de ajuste.
4. Para configurar a gravação de lapso de tempo, abra a janela 6D Multidimensional Aquisição no software Axiovision e selecione a opção z-stack e time-lapse.
5. Opcional) Na guia z-stack e Modo Slice, selecione a espessura de corte e, em seguida, selecione o modo de Start / Stop.
6. Definir a posição superior e inferior da pilha.
7. Na guia de lapso de tempo, selecione o intervalo e a duração do filme e, em seguida, iniciar o filme pressionando o botão de partida. Descobrimos que a intervalos de 30 minutos são suficientes e neste intervalo não gera dados excessiva; no entanto Shortepode ser utilizado o intervalo r.
8. Verificar as dimensões de posição e z-stack durante a primeira hora, se a larva não foi pré-ajustado. Se necessário, reposicionar a larva de novo depois de um dia, como a larva pode ter deslocado.
9. Salve o arquivo no final da gravação de lapso de tempo e continuar com o pós-processamento e quantificações usando software de análise de imagem disponíveis, tais como Imaris ²⁵ ou o open source pacotes de software Imagem J ²⁶ e ^{27 de} Fiji.

Análise 7. Dados

1. A determinação do comprimento da aleta.
   1. Abra o filme de lapso de tempo no software de imagem e salvar os arquivos no formato de arquivo proprietário para melhorar o desempenho do software.
   2. Selecione a vista ortogonal para exibir seções individuais como pilhas projetadas. Para a correção de deriva, sob o menu de Fiji, selecione Plugins, em seguida, Registro, e 'deriva 3D correcta'. Isto irá abrir uma janela de Fiji e realizar as correções de deriva. Corretodesvio rotacional no Spots função Imaris. Como alternativa, instalar os plugins StackReg e TurboReg em Imagem J e importar para Fiji. Escolha o algoritmo de transformação desejada no plugin StackReg.
   3. Para medir distâncias (por exemplo, diâmetro da ferida ou comprimento fin), selecione a opção "adicionar novos pontos de medição" na barra de ferramentas superior esquerdo.
      1. Em 'lista Configurar de Estatísticas visíveis Valores "no menu inferior esquerdo, selecione os valores de estatística a ser exibido.
      2. No "Modo de linha ', na guia configurações, selecione' Pairs (AB, CD ...) '.
      3. Em 'Labels Propriedades' selecionar 'Name' e 'Distância', para exibir a distância entre os pontos A e B ao lado da linha de medição.
      4. Alternar para o modo "Editar" e mantenha pressionada a tecla Shift para selecionar o primeiro ponto no final da notocorda. Em seguida, use a mesma configuração para selecionar o segundo ponto na margem fin distal.
      5. Na aba "Estatísticas", selecione o botão de disco (Export All) no canto inferior direito para exibir e exportar a distância na imagem.
      6. Repita as medições em momentos selecionados movendo o controle deslizante abaixo da imagem para a direita. Em vez de criar novos pontos de medição, os anteriores podem ser reposicionados selecionando primeiro o ponto com o botão esquerdo do mouse, em seguida, pressionando simultaneamente a mudança e com o botão esquerdo do mouse na nova posição.
   4. Em alternativa à opção de pontos de medição, utilizam o espectador fatia para medir distâncias. No modo de exibição fatia, vá até a posição desejada e clique na primeira e segunda posição com o botão esquerdo do mouse. A distância será exibida. Essa opção, entretanto, não permitem a exportação de dados.
2. Determinando comprimento da nadadeira e área em ImageJ.
   1. Abra o filme de lapso de tempo em ImageJ usando um plugin que reconhece o formato de arquivo .zvi. Em alternativa, carregue em um Quarquivo ickTime ou seqüência tiff.
      Nota: Se estiver usando um formato de arquivo TIFF, as dimensões da imagem não precisa ser especificado.
   2. Se abrir um formato de arquivo diferente, sem as informações do arquivo, selecione 'Definir Scale' no menu 'Analisar' para primeiro definir a distância e unidade de imagem. No "Menu Scale", digite o 'Distância em pixels', abaixo do tipo na "distância conhecida 'para o valor de pixel (isso pode ser obtido através da medição do número de pixels em uma barra de escala que foi acrescentado à imagem e clique em Medir para obter o resultado), e os 'Unidade de comprimento "(tipicamente' mm '). Em seguida, clique em OK.
   3. Para a medição da área fin selecione a ferramenta 'Seleção Freehand "na barra de ferramentas e delinear a área fin, segurando o botão esquerdo do mouse pressionado enquanto desenha ao longo do contorno da barbatana. Para medições de comprimento da nadadeira, selecione a ferramenta 'Straight' linha e desenhar uma linha entre os pontos desejados para sermedido.
   4. Clique na opção "Measure" em "Analisar" para exibir a área e comprimento da nadadeira. Repita este passo quantas vezes for necessário para vários pontos no tempo do filme.
3. Usando estatísticas software os dados podem ser apresentados graficamente.

Results

A técnica apresentada é adequada para elucidar dinâmica de reparação de tecidos, em resposta à amputação. O filme demonstra que a amputação da barbatana inicialmente desencadeia um efeito em bolsa, caracterizado por contracções por meio de cabos de actina-miosina que estão presentes na aleta ²⁸ vezes (Figura 5 A, B). Concomitantemente, as células são extrudados da ferida (ver filme). A contracção pode assim constituir um meio para expulsar as células que são susceptíveis destinados a sofrer morte celular. Os nossos resultados mostram ainda que o crescimento de desenvolvimento da larva ocorre independentemente de regeneração (filme), enquanto a regeneração de aleta não iniciar até cerca de 14 horas após a amputação, conforme medido pelo comprimento da aleta e a área ao longo do tempo de 36 horas após a amputação (Figura 5C , D). O crescimento total de barbatana regenerativo após 1,5 dias foi de cerca de 60% ​​do comprimento da aleta original (Figura 5E). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que tr amputação Iggers contracção barbatana, extrusão de células a partir da ferida, e uma resposta regenerativa temporalmente retardada. Enquanto as células são extrudidos provável destinado a passar por morte celular, a natureza destas células tem de ser clarificado.

Figura 1. Imagem conjunto do anel de câmara

(A) é mostrado um anel de plástico que está ligado a uma lamela com massa de silicone. Uma malha de plástico é fixada no interior da câmara com quatro pequenos pontos de gordura de silicone. (B) A câmara contendo a larva montado é cheio com solução tricaina uma lâmina de vidro e está conectado à parte superior. (C) A 2 dias de idade larva (seta) é mostrado em maior ampliação para descrever o seu tamanho em relação à malha montado."_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagem câmara montagem feita a partir de placas de Petri. (A) É mostrado um copo comercial tampo de vidro placa de Petri de fundo com uma malha de plástico ligado à lamela de vidro. (B) é mostrado um prato de Petri câmara auto-construída com um buraco perfurado na tampa e uma lamela ligado do lado de fora com massa de silicone. A malha de larva e estão montados no interior da câmara que contém a solução tricaina. Para selar a câmara, graxa de silicone é aplicado na borda superior externa da câmara de fundo e tampa superior em anexo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Esquema de amputação e montagem de uma larva para a imagem latente. (A) para a amputação, coloque uma larva anestesiados em uma placa de Petri revestidas de agarose e amputar a nadadeira caudal com uma agulha de seringa. (B) Para a montagem, transferir a larva com uma pipeta para um tubo de 1,5 ml cheio com 42 ° C de agarose e pipetar um líquido contendo a larva gota na câmara de imagiologia, orientar o peixe e cobrir o solidificado de agarose com forma embrião. (C) Raspar a agarose a partir da barbatana caudal usando uma ponta tapada pipeta microloader ou ferramenta semelhante e substituir médio embrião por meio fresco. (D) Imagem da barbatana caudal sob microscópio estereoscópico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. construído Self-câmara de incubação aquecida. (AC) É mostrada uma câmara de incubação aquecida feita de papelão, plástico bolha e Velcro. Um aquecedor de cúpula com fio (originalmente projetado para incubação de ovos de galinha) está ligado à câmara usando fita de alumínio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. dinâmica da regeneração Fin. (A) Esquema do método de ensaio de amputação e quantificação barbatana caudal utilizado para determinar o comprimento da nadadeira (seta vermelha) e área (contorno vermelho da fin). (B) Cauda amputação fin inicialmente desencadeia a contração da barbatana, seguindo-se regeexcrescência tecido nerative. A barbatana também passa por crescimento, de desenvolvimento, como evidenciado pelo aumento de tamanho lateral. (C) É mostrado o comprimento da aleta como uma função do tempo, revelando uma partida crescimento regenerativo linear em ~ 14 hPa. (D) Quantificação da área revela uma barbatana inicialmente diminuir em tamanho, o que pode ser atribuído à contracção da barbatana. Depois de ~ 14 horas, o tamanho aumenta fin a uma taxa linear. (E) Comparação do comprimento da nadadeira antes da amputação e depois de 36 horas mostra ~ 60% rebrota. Barra de escala: 100 um Abreviaturas: pré-amplificador, pré-amputação; horas após a amputação, hpa; regen, regeneração; amp, amputação por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme . A regeneração da barbatana sobre o curso de tempo de 36hr. É mostrada uma aleta da cauda de um velho larva 2,5 dias durante o curso de regeneração. A partir de 30 min pós amputação crescimento regenerativo é fotografada em intervalos de 30 min em um microscópio estereoscópico usando uma lente objetiva de 3,5x.

Discussion

O método apresentado permite observar a cicatrização e regeneração de tecidos em viver com larvas do peixe in vivo time-lapse de imagens em uma lupa estereoscópica brightfield, usando um relativamente simples set-up. Este procedimento requer alguns aspectos importantes que nós testamos, que irão otimizar o resultado: 1) as concentrações de agarose de baixo (~ 0,5%) irá minimizar os impedimentos de crescimento do contínuo crescimento do peixe-zebra larval, 2) A remoção do agarose em torno do fin é importante não a obscurecer o processo de cura, 3) Trapping a agarose numa malha de plástico mantém a agarose e animal numa posição estável durante o procedimento, e 4) Um ambiente de temperatura controlada adequada, o que é essencial para a viabilidade das larvas. Temos adaptado numa câmara aquecida incubação ^23,24, que utiliza bolha que é gravado no cartão, e uma cúpula de aquecedor fios para controlar a temperatura e correcta circulação de ar com flutuações mínimas durante oprocedimento de imagem. Esta câmara simples e eficiente em termos de custo pode estar preparado para se adaptar a qualquer microscópio. A câmara de incubação aquecida semelhante foi também utilizado para ratos de imagem e desenvolvimento pintinho ^24,29.

Sugerimos que as larvas pré-amputado são montadas uma imagem de pré-amputação por, desmontado para a amputação, e remontado para geração de imagens de lapso de tempo. Embora seja possível para executar essas etapas em um único passo na câmara de imagem final, em nossa experiência, descobrimos que amputar a nadadeira da cauda em uma lamela de vidro não é o ideal, uma vez que rasga o tecido e não resulta em um corte limpo. O método baseia-amputação de agarose utilizando uma agulha de seringa foi originalmente descrito por Kawakami et al (2004) ¹⁶ e é também, na nossa experiência, ideal para executar as amputações. Assim, a série um pouco complicado de passos que apresentamos é bem justificada e garante um resultado regeneração ideal.

Nós mostramos que LarVal zebrafish em 2 dpf pode ser trabalhada até 1,5 dias em agarose e solução tricaina. Nós solução optimizado-tricaina pH (pH 7), preparado com sal Instant Ocean, que não interfere com a saúde da amostra para o período de imagem apresentada utilizado. Anteriormente, no entanto, também demonstrou que o uso de tricaina em meio Danieau permite time-lapse de imagens de 2,5 dpf zebrafish larval em um microscópio confocal para pelo menos 2 dias ^30. Assim, as condições óptimas de tampão pode estender saúde das larvas e a duração das imagens. Em alternativa, as concentrações mais baixas tricaina podem ser utilizados para anestesia, ou 2-fenoxietanol, o que foi bem tolerado durante as fases de larvas e de adultos, a 28 ° C durante pelo menos 60 horas.

Para evitar defeitos de regeneração fin, nós removemos o agarose a partir da barbatana caudal antes da imagem. Os nossos dados indicam que no intervalo de 1,5 dias, a aleta tem regenerada até cerca de 60%. Esta taxa de regeneração é consistente com um estudo anterior que define 3 dias poré um tempo médio de regeneração barbatana caudal em larvas do peixe até 6 dpf ^16. Métodos alternativos à agarose poderia, contudo, ser utilizados para montar o peixe para a imagem latente. Por exemplo, o plasma fina coagula ³¹ ou etileno propileno fluorado (FEP) com tubos revestidos de metilcelulose e encheram-se com concentrações muito baixas de agarose (0,1%) foram recomendadas para a microscopia de luz folha ³² e pode ser adequado para o nosso método apresentado. No entanto, não é recomendável metilcelulose e 0,1% de agarose, em que exigem que a amostra são montados na parte inferior da câmara, devido à falta de solidificação destes meios. Concentrações muito elevadas de metilcelulose, além disso, irá gerar bolsões de ar com base em nossa experiência, e estes podem interferir com o processo de criação de imagens. Se estes meios são os preferidos com a utilização da câmara inferior, é importante que uma distância de trabalho adequado entre a lente objetiva ea amostra está presente. Deve notar-se que metilcelulose como um meio de montagem é recomendada apenas para até 1 dia, pois pode interferir com a saúde larval ^32.

Montando o modelo na tampa pode resultar em um desvio gravitacional para baixo lento. Portanto, é recomendável a imagem várias seções em cada ponto de tempo, que pode ser projetada em um único avião ou apenas imagens que estão no plano focal pode ser extraído para a montagem do filme final. Imaging o espécime na câmara inferior poderia ser uma metodologia alternativa para evitar o potencial de deriva para baixo. Coágulos de plasma pode ser útil para evitar a deriva, como o plasma vai ficar com a camada envolvente exterior (EVL, periderme) ³¹ e, portanto, pode estabilizar o espécime. Este no entanto tem de ser testada, bem como o tempo de larvas de peixe-zebra pode ser mantida em coágulos de plasma sem interferir com a saúde das larvas ou a regeneração da barbatana.

Nosso filme foi montado utilizando seções individuais (26 mm)de uma pilha de z-gravada, que cobria a totalidade da espessura da aleta (~ 10 mm) e que representava potencial z deriva da barbatana durante o procedimento de imagiologia. A fim de reter a informação em 3-D, é também possível projectar-z pilhas em imagens individuais. Porque isto pode resultar em desfocagem da imagem, desconvolução de campo claro podem ser desejada. Software, tais como deconvoluir ou X3 Autoquant poderia ser utilizado para este fim. Alternativamente, os algoritmos matemáticos (descritos em Tadrous ³³⁾ pode ser aplicado para a obtenção de um ponto de função propagação de elevada relação de sinal-para-ruído (SNR). A obtenção de um elevado SNR representa um dos principais obstáculos em campo claro de desconvolução. Embora este método requer alto contraste e espessura da amostra fina, que seria adequado para a imagiologia da barbatana da cauda, ​​devido à sua largura reduzida.

Uma clara vantagem do método de imagem apresentada é que é rapidamente adaptável a qualquer um estereomicroscópio equipado com uma câmara CCDd software time-lapse e oferece uma alternativa de baixo custo para sistemas de imagem confocal mais caros. Embora este método não utiliza fluorescência para a detecção de células, ele pode ser estendido para tais aplicações, utilizando um sistema automatizado de controle do obturador e pós-imaging software deconvolution ^34. Isso permitiria que os usuários observem ainda mais os processos de reparação de feridas e regeneração com única célula ou resolução subcelular durante períodos de tempo mais longos.

A claridade óptica e facilidade com que embrionário e zebrafish larval pode ser tratada, e da capacidade de adaptação do método para qualquer microscópio estereoscópico o torna adequado para o ensino de biologia básica vertebrado em uma sala de aula. Este método pode proporcionar aos alunos uma melhor compreensão dos processos biológicos básicos subjacentes reparo e regeneração tecidual. Outros processos biológicos que foram capturados com um método semelhante são o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra ^23,34 e cardíacafunction (não publicado). Este método também oferece a possibilidade de reparação de feridas e a regeneração de monitorização em larvas que foram geneticamente manipulados e farmacologicamente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bullseye Agarose	MidSci	BE-GCA500
Low-melt agarose	Fisher BioReagents	BP1360-100
1-fenil-2-tioureia	Alfa Aesar	L06690
Sal de Aquário Instantâneo Oceano	Pet store
Azul de Metileno (solução a 0,1%)	Sigma	M9140
Tricaine (metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato)	Sigma-Aldrich	E10505
2-Fenoxietanol	Sigma-Aldrich	77699
Placa de Petri 35 x 15 mm	BD Falcon	351008
Placa de Petri 60 x 15 mm	BD Falcon	351007
Placa de Petri 100 x 25 mm	BD Falcon	351013
Pipetas de vidro boroschillate de 5,75 polegadas	Fisher
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (Glass: 0.085-0.115mm)	MatTek Corporation	D35-20-0-TOP
Superfrost/Plus lâminas de microscópio	Fisherbrand	12-550-15
Glass	coverscopy Services	72191-75
	Warner Instruments	CS-18R15
Phifer Phiferglass Tela de Insetos Carvão - 48"	Home Depot
Graxa de alto vácuo	Dow Corning
20 µ l	Eppendorf	930001007
Tesoura Fina - Sharply Angled Up	Ferramentas de Ciência Fina	14037-10
Seringa descartável Luer-Lok™ de 3 ml	BD	309657
60 ml Luer-Lok™ seringa descartável	BD	309653
23 G agulhas de seringa	BD	305145
Dumont #5 Pinça Fine	Science Tools	11295-00
Equipment
LabDoctor Mini Banho Seco	MidSci
Discovery.V12 microscópio composto	Zeiss
Plan Apo S 3.5X objetiva	Zeiss
AxioCam MRm	Software Zeiss
Axiovision, versão 4.8.2SP1 (12-2011)	Zeiss